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Jan 09, 2024

국소적 분화를 통해 오가노이드를 생성하고 이미징하기 위한 CUBE 워크플로 분할에 대한 그라데이션

커뮤니케이션 생물학 볼륨

커뮤니케이션 생물학 6권, 기사 번호: 299(2023) 이 기사 인용

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오가노이드 배양의 발전으로 인해 다양한 방식으로 천연 조직을 모방하는 다양한 체외 미니 기관이 탄생했습니다. 그러나 신체 축 패터닝을 사용하여 복잡한 오가노이드를 생성하고 실험 후 분석 과정에서 오가노이드의 방향을 유지하는 데 병목 현상이 남아 있습니다. 여기에서는 CUBE 배양 장치를 사용하여 모르포겐 그라데이션으로 오르가노이드를 배양한 다음 CUBE로 샘플을 분할하여 그라데이션 방향에 대한 정보를 유지하는 워크플로우를 제시합니다. 우리는 CUBE의 반대쪽 끝에서 두 개의 분리된 분화 배지로 배양된 hiPSC 회전타원체가 대조군의 마커의 균질한 분포와는 대조적으로 각각의 분화 마커의 국소화된 발현을 초래한다는 것을 보여줍니다. 또한 그라데이션 방향 정보를 유지하기 위해 CUBE에서 회전타원체의 저온 및 파라핀 절편 프로세스에 대해 설명합니다. 그라디언트 배양에서 CUBE를 사용한 단면화까지의 이 워크플로우는 연구자에게 점점 더 복잡해지는 오가노이드를 생성하고 체외에서 발달 과정을 연구할 수 있는 편리한 도구를 제공할 수 있습니다.

만능줄기세포(PSC)와 그로부터 파생된 오가노이드는 실제 표본이 도전적인 윤리적 문제를 제기하기 때문에 초기 인간 발달 과정에서 조직과 기관의 형성을 모델링하고 연구하는 실용적인 방법을 제공합니다1,2,3,4. 자연 조직을 모방하는 다양한 오가노이드를 생성하기 위한 프로토콜은 일반적으로 Nodal, Hedgehog, Notch, Wnt 또는 BMP와 같은 신호 전달 경로의 활성화 또는 억제를 순차적으로 조작하여 특정 계통으로의 분화를 유도하는 데 의존합니다. 장5, 신장6 및 폐7 유기체, 상피모세포8,9 및 위배체10의 생성.

그럼에도 불구하고 신체 축을 따라 세포의 성장과 분화를 제어하는 ​​것은 3D 오가노이드 배양에서 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 시험관 내에서 오가노이드의 전후 및 등-복부 패턴화는 세포 자체 조직에 의해 발생하거나11,12 서로 다른 뇌 영역을 가진 대뇌 오가노이드 또는 간, 담도가 있는 담즙 오가노이드와 같이 별도로 분화된 오가노이드를 집합체로 융합하여 달성할 수 있습니다. 기관 및 췌장 성분13,14. 그러나 이러한 방법의 한계는 세포가 하나의 균일한 배지에서 배양되기 때문에 세포에 제공되는 공간 정보 측면에서 제어 수준이 매우 낮다는 것입니다. 오가노이드를 구성하는 세포 클러스터 내의 모든 세포는 배지의 신호 분자로부터 동일한 분화 신호를 받습니다. 반면에, 생체 ​​내에서 다른 소스로부터의 모르포겐의 농도 구배는 세포가 어디로 가는지, 발달 중에 어떤 표현형이나 패턴을 채택해야 하는지를 통제하는 데 기여합니다15,16. 예를 들어, 신경관의 형성은 척색과 비신경 외배엽층의 신호에 의존하며, 신장의 네프론은 요관 싹과 후신 간엽 사이의 다양한 신호 교환에 의해 발달합니다18. 따라서 생체 내에서 천연 조직과 더욱 유사한 오르가노이드를 생성하기 위해서는 모르포겐 구배를 복제할 필요가 있습니다.

시험관 내에서 신호 분자의 공간적 구배를 세포에 공급하는 것을 모방하기 위해 여러 엔지니어링 기술이 개발되었습니다. Sonic Hedgehog(Shh)19 또는 모르포젠에 담근 아가로스 비드20를 발현하도록 조작된 PSC는 발달하는 오가노이드 가까이에 배치할 수 있으며 소스에서 분화 세포로의 분자 확산으로 모르포젠의 고농도에서 저농도 구배가 생성됩니다. 또한 세포가 두 개의 별도 미디어 구획으로 배양될 수 있도록 하는 다양한 변형 트랜스웰 및 마이크로 장치도 개발되어 세포 전반에 걸쳐 반대 방향으로 모르포겐 구배를 생성합니다. 그러나 이러한 기술에는 단점이 있습니다. (1) 전문 기술과 장비 없이 대부분의 생물학 기반 실험실에서 수행하기 쉽지 않은 복잡한 준비 및 설정 절차가 필요합니다. (2) 장치의 배치 및 위치에 대한 제어가 부족합니다. (3) 샘플에 많은 손상을 입히거나 샘플의 방향을 잃지 않으면서 추가 분석을 위해 실험 후 장치에서 샘플을 회수하는 것이 어렵습니다. 특히, 세포에 적용되는 그라데이션 방향에 대한 정보를 유지하는 능력은 샘플의 적절한 분석을 보장하는 데 중요합니다.