Jun 03, 2023
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Nature Communications 13권, 기사 번호: 3385(2022) 이 기사 인용
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매우 희귀한 순환 종양 세포(CTC) 클러스터는 전이성이 높은 전구체로 점점 더 높이 평가되고 있으며 사실상 탐구되지 않은 상태입니다. 기술은 주로 단일 CTC를 감지하도록 설계되었으며 클러스터의 취약성을 설명하지 못하거나 더 높은 감도를 위해 클러스터별 마커를 활용하지 못하는 경우가 많습니다. 한편, CTC 클러스터를 대상으로 하는 소수의 기술에는 확장성이 부족합니다. 여기에서는 막 여과의 속도와 실용성을 미세유체 칩이 제공하는 민감하고 결정적인 스크리닝과 결합한 Cluster-Wells를 소개합니다. Cluster-Wells의 100,000개 이상의 마이크로웰은 처리되지 않은 전혈에서 CTC 클러스터를 물리적으로 정지시켜 사실상 모든 클러스터를 >25mL/h의 처리량으로 부드럽게 분리하고 실행 가능한 클러스터를 장치에서 검색할 수 있도록 합니다. Cluster-Wells를 사용하여 우리는 전립선암 및 난소암 환자로부터 2~100개 이상의 세포 범위의 CTC 클러스터를 분리하고 RNA 서열 분석을 사용하여 하위 집합을 분석했습니다. CTC 클러스터의 일상적인 분리는 암 관리에서의 유용성에 대한 연구를 민주화할 것입니다.
암 환자의 혈류에서 채취한 단일 순환 종양 세포(CTC)는 질병의 단계에 대한 귀중한 정보를 제공하고1 최소 침습적 예후 및 진단을 가능하게 하며2,3,4 세포 수준에서 전이에 대한 이해를 높이고5,6 암의 임상 관리를 개선할 수 있는 잠재력7,8. 이러한 단일 CTC 외에도 순환계에 부착된 상태로 남아 있는 CTC 응집체는 1950년대 이후 과학적, 임상적으로 큰 관심을 불러일으켰습니다. 이러한 CTC 클러스터 또는 순환 종양 미세 색전은 극히 드물지만(모든 CTC의 2~5%로 추정) 전이를 파종하는 데 불균형적으로 효율적입니다. 이들의 전이성 성향은 낮은 세포사멸률과 감소된 장기 생존 특성을 기반으로 단일 CTC9,10,11보다 100배 더 높은 것으로 추정됩니다9,12. 더욱이, 환자 유래 CTC 클러스터의 하위 집합에는 숙주 면역 세포가 포함되어 있는 것으로 밝혀졌으며13,14, 이는 종양-면역계 상호 작용과 전이에서의 역할을 밝히는 이러한 전이성 전구체의 유용성을 강조합니다. 예를 들어, 호중구를 운반하는 CTC 클러스터는 진행성 유방암 환자에서 전이 가능성이 증가한 것으로 나타났습니다14. 여기서 호중구 관련 CTC는 증식 표지 단백질(Ki67) 및 세포 주기 진행과 관련된 유전자의 더 높은 발현 수준을 보여줍니다. 임상 연구는 CTC 클러스터의 존재가 더 짧은 무진행 생존 기간 및 전체 환자 생존 기간과 관련이 있다는 사실을 밝혀 이러한 생물학적 조사 결과를 뒷받침했습니다15. 따라서 CTC 클러스터에 대한 연구가 증가하면 전이에 대한 이해와 관리를 향상시키는 데 큰 가능성을 제공합니다.
현재까지 CTC 분리 기술의 민감도와 특이성은 주로 단일 세포 검출을 위해 보정되었기 때문에 실행 가능한 CTC 클러스터의 안정적이고 효율적인 분리가 제한되었습니다. 예를 들어 미세여과 기술은 빠르고 간단한 작동으로 인해 CTC 분석법으로 널리 사용됩니다16,19,20. 그러나 생리학적 압력을 받는 CTC 클러스터는 단일 파일 사슬형 구조로 재구성되고 5μm11만큼 작은 수축을 횡단할 수 있습니다. 이는 여과에 사용되는 훨씬 더 높은 압력을 고려할 때 응집체가 필터 기공을 통과할 가능성이 있음을 시사합니다. 더욱이 정밀여과 중에 발생하는 더 높은 전단력은 CTC 클러스터를 손상시키거나 단일 세포21로 분리시켜 효율적인 농축을 저해할 수 있습니다. 반면, 단일 CTC 분리에 오랫동안 사용되어 온 항체 기반 농축 시스템은 특정 막 항원에 대한 의존성으로 인해 이종 CTC 집단 내에서 CTC 클러스터의 선택된 하위 집단만 검출할 수 있습니다. ,24. 또한 CTC 클러스터의 표면적 대 부피 비율이 작을수록 항체 기반 기술의 면역포획 효율성에 부정적인 영향을 미쳐25 CTC 클러스터 농축에 특히 비효율적입니다. 이와 관련하여 더욱 유망한 것은 상대적으로 더 높은 감도를 달성할 수 있는 CTC 클러스터를 특별히 표적으로 삼는 최근의 미세유체 칩입니다. 불행하게도 그들은 임상적으로 실행 불가능한 처리 속도21,26 또는 좁은 채널의 높은 유속으로 인해 클러스터 손상의 위협을 받고 있습니다27. 이는 때때로 수십 개로 구성되는 것으로 보고된 대규모 클러스터와 특히 관련된 문제입니다 종양 세포28.
4) shots of each cluster, ensuring none of the clusters were missed and (2) capture multiple different conformations within the field of view, increasing the accuracy of cluster size estimation. We validated (see "Methods": measurement of the device sensitivity) the optimized characterization setup by operating the 2-channel microfluidic interface in a loop without the device attached to confirm there were no cell loss in the system (Supplementary Table 1) and also by ensuring the cluster counts obtained using our setup matched with the direct counts of the captured clusters on the device (Supplementary Fig. 4)./p>500 mL/h, spiked cell clusters dissociated in the device, as evidenced by the mismatch observed between the size distributions of spiked and processed cell populations (Supplementary Fig. 5)./p>2× (87% vs 37%) the efficiency of the Cluster-Chip (Supplementary Fig. 8). Even when compared to the reported release efficiency of a Cluster-Chip operated at 4 °C to reduce non-specific cell adhesion to the microfluidic chip, the Cluster-Wells demonstrated greater efficiency (87% retrieval for the Cluster Wells vs 80% for the Cluster-Chip)./p>150 cells, with the latter found in a sample from an ovarian cancer patient (Fig. 4a, iii). Besides raising questions on the physiological circulation of CTC clusters, the surprisingly large size of the isolated ovarian cancer CTC cluster points to a potential drawback of microfluidic chips, even if they are designed with CTC clusters in mind: a CTC cluster of this size would have likely clogged narrow microfluidic channels or split into smaller pieces if forced through. Some of the isolated CTC clusters were also found to contain leukocytes in both ovarian and prostate cancer samples (Fig. 4a, ii and b, iii), an observation consistent with previous reports on breast cancer CTC clusters14. To confirm physical cohesion between cells in these leukocyte-associated CTC clusters, such clusters were purposely expelled from microwells and then recaptured./p>50 rpm) of CD44. It has been previously reported that CD44 homophilic interactions and subsequent CD44–PAK2 interactions mediate tumor cell aggregation42 and improve stemness, survival, and metastatic progression43,44. Similarly, all CTC clusters expressed high levels of TIMP1, JUN, and FOS, which are known to stimulate cell proliferation, inhibit apoptosis, and regulate angiogenesis45,46. Furthermore, we have performed overrepresentation enrichment analysis for the "TOMLINS_PROSTATE_CANCER_UP" gene set from the MSigDB database at the Broad Institute, which lists the genes that are upregulated in prostate cancer compared to benign tissue47. As observed from the heatmap plot, all CTC clusters as well as prostate cancer cell lines expressed high levels of these genes consistent with their prostate tumor origin. We have also performed a similar analysis for the "CHANDRAN_METASTASIS_TOP50_UP" gene set from the MSigDB database, which includes the genes upregulated in metastatic prostate cancer tumors compared to the primary tissue48. Upregulation of the genes associated with metastasis in all clusters is in agreement with the enhanced metastatic potential of CTC clusters9,10. Among the set, we observed the highest expression levels in HSPD1 and HSP90AA1 genes that are members of heat shock proteins (HSPs), playing important roles in cancer development and invasion, progression, metastasis, and drug resistance in various cancer types49,50. Also, all CTC clusters expressed high levels of G3BP1 which has been correlated with the malignant degree of the tumor51 and observed to be most abundant in castration-resistant prostate cancer (CRPC)52, which agrees with the clinical diagnosis of both Patient-1 and Patient-2 (Supplementary Table 2)./p>150 cells in the samples tested, two observations seemingly at odds with each other and which have potential implications for the circulation of CTC clusters in the body. The frequency of CTC clusters in the peripheral blood of ovarian cancer patients may present valuable opportunities for further study to better understand hematogenous dissemination of ovarian cancer55 as well as opportunities for early detection of disease onset and tumor recurrence—two major problem areas for ovarian cancer, since the disease is asymptomatic early in its progression/recurrence56./p>250 mL/h, respectively. Smaller diameter devices were mounted to a commercially available 13 mm diameter filter holder (GE Healthcare Life Sciences) with a size matching hollow PDMS layers, which limit the fluid flow to the region of interest with a certain diameter and prevent stagnant flow region formation inside the filter holder. Before introducing the sample, the experimental setup (Fig. 2b) was primed with pure ethanol, which was followed by a PBS wash. Then, the setup was incubated with 3% bovine serum albumin (BSA) for 1 h to minimize non-specific cell adhesion. The Hoechst dye stained cells (see separate section on cell culture and preparation) were spiked into whole blood and run through the experimental setup using a syringe pump (Harvard Apparatus Infuse/Withdraw PHD Ultra) at the withdrawal mode. The blood with spiked cell clusters traversed through input channel (50 μm in height, 500 μm in width) of 2-channel microfluidic interface, device/filter holder assembly, and lastly, output channel (50 μm in height, 500 μm in width) of the microfluidic interface. The input and output microfluidic channels were simultaneously video recorded at 50 frames per second in fluorescent (DAPI) channel using an inverted fluorescence microscope (Eclipse Ti, Nikon, Melville, NY) for tracking the cells entering and exiting the analytical version of the Cluster-Wells, respectively. Then, the recorded video was processed by a custom-built software (Visual Studio, 2017), and the count of clusters entering and leaving the device was obtained with respect to number of cells within each cluster, which is used for the calculation of the capture efficiency./p>24). Trimmed reads were mapped to the hg38 build of the human genome using STAR mapper (PMID: 23104886) and transcripts were quantified by mapping to the GenCODE.v24 annotation version of the human transcriptome. For these prostate CTC clusters, a median of 83.15 M reads were input to STAR mapper (range 53.7–129.79 M), and a median of 88.8% reads mapped uniquely to the human transcriptome (range 80.57–91.59%). A total of 16,412 transcripts were detected with at least 10 mapped reads in one sample and used for DESeq2 analysis in R (PMID: 25516281). A total of 12,149 mapped Ensembl genes ranked by DESeq2 log2foldchange were used as input for GSEA analysis (PMID: 17644558), using the WebGestalt tool (PMID: 28472511). Enriched gene sets were analyzed using the Cancer Hallmark 50 gene sets and the KEGG Pathway gene sets. t-SNE analysis was performed in R using the M3C package with seed = 123 and perplexity = 1. Total read counts were normalized to FPKM values using Cufflinks (PMID: 22383036). A total of 26,391 transcripts had an FPKM > 1 in at least one sample, and 10,885 transcripts had a median FPKM > 1. To be used in the heatmap plot, reads per million (RPM) count for the genes was generated. Lastly, the heatmap plot was generated using ClustVis online tool./p>3.0.CO;2-9" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291521-4095%28199908%2911%3A11%3C946%3A%3AAID-ADMA946%3E3.0.CO%3B2-9" aria-label="Article reference 32" data-doi="10.1002/(SICI)1521-4095(199908)11:113.0.CO;2-9"Article CAS Google Scholar /p>
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